2022年8月2日，The Plant Journal雜志在線發(fā)表了德國亞琛大學(xué)和馬普所Acevedo-Garcia等人題為“Barley Ror1encodes a class XI myosin required formlo-based broad-spectrum resistance to the fungal powdery mildew pathogen”的研究論文。作者們克隆了大麥白粉病廣譜抗性基因Mlo介導(dǎo)抗病反應(yīng)所必需的Ror1，并對(duì)其蛋白結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析。該基因編碼XI類肌球蛋白，部分與過氧化物酶體共定位，可能驅(qū)動(dòng)細(xì)胞內(nèi)抗菌或細(xì)胞壁組分等的轉(zhuǎn)運(yùn)過程，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞外免疫。
一、研究背景
Mlo（Mildew locus o）基因功能缺失（mlo）可介導(dǎo)大麥對(duì)白粉病的廣譜和持久抗性，同時(shí)該基因在多種單子葉和雙子葉植物中功能保守，其突變型也具有白粉病等病菌抗性。Mlo基因編碼具有7個(gè)跨膜螺旋結(jié)構(gòu)的膜蛋白，C-端和N-端分別位于細(xì)胞內(nèi)外，其中C-端尾部含有鈣調(diào)蛋白結(jié)合域，與鈣調(diào)蛋白結(jié)合介導(dǎo)致病菌侵染。過去的研究通過EMS誘變Ingrid背景下的高抗性mlo-5，在M2代發(fā)現(xiàn)了部分感病材料，進(jìn)一步利用這些材料鑒定到兩個(gè)不同的位點(diǎn)Ror1和Ror2（required for mlo resistance），Ror1和Ror2是mlo介導(dǎo)抗病反應(yīng)所必需的。其中Ror2基因被成功克隆，該基因編碼SNARE（solubleN-ethylmaleimide-sensitive factor attached protein receptor）蛋白，定位于質(zhì)膜上，通過與SNAP34和VAMP721蛋白形成三元復(fù)合物進(jìn)而參與抗病反應(yīng)。Ror1基因被定位于大麥1H染色體長(zhǎng)臂著絲粒周圍，重組率低且該區(qū)段與水稻共線性差，因此未能成功克隆。
肌球蛋白（myosin）是真核細(xì)胞內(nèi)的一類ATP依賴型分子馬達(dá)，對(duì)細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)與細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)傳輸起著重要的作用。在植物中，肌球蛋白可以結(jié)合不同類型的物質(zhì)，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)過程。植物中的肌球蛋白只有兩類，即VIII類和XI類，它們?cè)诮Y(jié)構(gòu)域、分子量和動(dòng)力學(xué)特性等方面有所不同。目前，VIII類蛋白的功能尚不明確，XI類蛋白被報(bào)道參與細(xì)胞器沿肌動(dòng)蛋白微絲的運(yùn)動(dòng)過程。
二、研究結(jié)果
2.1 Ror1基因的定位與克隆
大麥Ror1基因最早由Collins等（2001）定位在1H染色體0.2-0.5 cM的遺傳區(qū)間內(nèi)，后來Acevedo-Garcia等（2013）進(jìn)一步篩選大麥YAC文庫，利用染色體步移的方法，將Ror1定位到大麥1H染色體長(zhǎng)臂近著絲粒0.18 cM遺傳區(qū)間，側(cè)翼標(biāo)記為AK375542（Pol）和AK355699（Con）。在當(dāng)時(shí)，基因組組裝主要利用細(xì)菌人工染色體（BAC）簇，BAC簇的排序方式有多種。與遺傳作圖相比，利用Hi-C可對(duì)著絲粒附近區(qū)域的BAC簇進(jìn)行排序，Hi-C圖譜將按連續(xù)順序（bin）將每個(gè)BAC簇分配到染色體上。
在本研究中，作者利用BLAST確定前期定位的Ror1側(cè)翼基因在基于Hi-C組裝的大麥基因組上的位置，大多數(shù)基因位于bins 205–211之間，相當(dāng)于約12 Mb的區(qū)間內(nèi)。通過觀察這些基因的順序，發(fā)現(xiàn)與水稻相比，在Ror1基因側(cè)翼的一組共分離標(biāo)記在大麥中發(fā)生了倒位，導(dǎo)致離Ror1基因最近的側(cè)翼標(biāo)記由AK375542（Pol）變成AK250464（圖1），該基因定位在AK250464（HORVU.MOREX.r3.1HG0046150）和AK371545（HORVU.MOREX.r3.1HG0046850, Con）之間，相當(dāng)于Hi-C bins 208和209，作者們推斷Ror1基因位于這兩個(gè)簇上或它們之間。這兩個(gè)相鄰的BAC庫之間的距離小于180 kb，HORVU.MOREX.r3.1HG0046150與HORVU.MOREX.r3.1HG0046850之間共有50個(gè)注釋基因，包括26個(gè)高置信度基因。
圖1 Ror1側(cè)翼基因在大麥中的倒位
接下來，作者通過對(duì)6個(gè)化學(xué)誘變的mlo-5ror1雙突變體與親本BC Ingridmlo-5（mloRor基因型）進(jìn)行RNA-Seq比較分析來確定Ror1。將獲得的所有基因型的RNA-Seq讀長(zhǎng)與目標(biāo)區(qū)間內(nèi)的BAC進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)多個(gè)mlo-5 ror1雙突變體的MLOC_19838和MLOC_52235基因發(fā)生突變，兩個(gè)基因注釋都為肌球蛋白XI類基因。對(duì)序列進(jìn)行進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)它們屬于同一個(gè)肌球蛋白XI類基因。作者將完整的候選基因進(jìn)行組裝，結(jié)合RNA-Seq讀長(zhǎng)，發(fā)現(xiàn)該復(fù)雜的基因由39個(gè)外顯子組成（圖2A），編碼1,509個(gè)氨基酸，在最新的Morex基因組上注釋為HORVU.MOREX.r3.1HG0046420，Ingrid品種的該基因與Morex的編碼序列一致，mlo-5 ror1-1和mlo-5 ror1-2突變體的基因編碼區(qū)發(fā)生氨基酸的替換，mlo-5 ror1-3、mlo-5 ror1-5、mlo-5 ror1-6和mlo-5 ror1-7的基因發(fā)生錯(cuò)義剪切，導(dǎo)致該基因提前終止。為了明確在目標(biāo)區(qū)間內(nèi)是否存在其他基因的變異，作者通過將RNA-Seq讀長(zhǎng)與最新的Morex V3基因組比對(duì)，只發(fā)現(xiàn)mlo-5 ror1-2突變體在HORVU.MOREX.r3.1HG0046420的誘導(dǎo)突變，沒有發(fā)現(xiàn)其它的突變基因，說明HORVU.MOREX.r3.1HG0046420是Ror1候選基因。
2.2 Ror1蛋白結(jié)構(gòu)和進(jìn)化樹分析
與其它的XI類肌球蛋白相似，Ror1的結(jié)構(gòu)如圖2B所示。利用大麥、水稻和擬南芥中的肌球蛋白進(jìn)行進(jìn)化樹分析，表明Ror1與擬南芥AtMyo11A1和AtMyo11A2，水稻Os02g0545000直系同源（圖2C）。蛋白印跡分析表明，7個(gè)突變體中僅有一個(gè)突變體ror1-1的Ror1蛋白積累量與野生型相似（圖3），其突變位點(diǎn)造成錯(cuò)義突變（G715E）。參考雞的肌球蛋白Myo5A三維結(jié)構(gòu)，該突變位點(diǎn)位于肌球蛋白關(guān)鍵結(jié)構(gòu)relay和converter的中間（圖4），relay是肌球蛋白產(chǎn)生動(dòng)力的元件，與核酸結(jié)合域和converter結(jié)構(gòu)域相連。relay和converter中間區(qū)域可以影響肌球蛋白動(dòng)力特性，包括ATP結(jié)合和水解，因此G715E可能對(duì)Ror1產(chǎn)生嚴(yán)重影響。此外，ror1-2也發(fā)生了錯(cuò)義突變（G156E）。
圖2 Ror1結(jié)構(gòu)和進(jìn)化樹分析
圖3 Ror1蛋白免疫印跡分析
圖4 蛋白三維結(jié)構(gòu)分析
2.3 Ror1蛋白水平和亞細(xì)胞定位分析
在白粉菌侵染24-72 h后，Ror1條帶最明顯，之后變?nèi)酰鋨110 kDa的剪切產(chǎn)物也具有相同的規(guī)律（圖5）。之后，作者們通過施用可以阻礙ATP結(jié)合的肌球蛋白抑制劑NEM（N-ethylmaleimide），發(fā)現(xiàn)ror1-4中白粉菌侵染性沒有顯著提高（圖6），推測(cè)Ror1可能是大麥中介導(dǎo)mlo抗病性的唯一肌球蛋白。亞細(xì)胞定位表明，大麥葉表皮細(xì)胞中YFP標(biāo)記的Ror1分布于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)（圖7），部分與可移動(dòng)的亞細(xì)胞區(qū)室共定位，如過氧化物酶體。因此，Ror1可能驅(qū)動(dòng)細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)和細(xì)胞器的轉(zhuǎn)運(yùn)過程，進(jìn)而介導(dǎo)細(xì)胞外的免疫。
圖5 白粉菌侵染后Ror1蛋白水平分析
圖6 藥理學(xué)分析
圖7 Ror1亞細(xì)胞定位
2.4 過表達(dá)Ror1的C-端造成顯性抑制效應(yīng)
過去的研究表明肌球蛋白C-末端的過表達(dá)會(huì)抑制肌球蛋白的功能。作者們通過瞬時(shí)過表達(dá)Ror1的C-末端蛋白（879-1509），發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生了與ror1突變體相似的表型，表明Ror1也具有顯性抑制效應(yīng)（圖8）。
圖8 過表達(dá)Ror1的C-末端蛋白分析
三、研究結(jié)論
本研究成功克隆了Ror1基因，該基因編碼XI類肌球蛋白，位于relay和converter界面的單個(gè)氨基酸突變可造成Ror1功能缺失。接種白粉菌之后Ror1蛋白水平顯著提高；Ror1部分與過氧化物酶體共定位，過表達(dá)C-末端蛋白造成顯性抑制效應(yīng)。Ror1可能驅(qū)動(dòng)細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)和細(xì)胞器的轉(zhuǎn)運(yùn)過程，進(jìn)而介導(dǎo)細(xì)胞外免疫。
原文鏈接
https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/tpj.15930
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